Parásitos y vectores volumen 15, Número de artículo: 290 (2022) Citar este artículoLa secuenciación de próxima generación (NGS) ha proporcionado una estrategia alternativa para estudiar la composición de las comunidades de nematodos con mayor resolución y sensibilidad.Sin embargo, el manejo y procesamiento de gigabytes de datos de secuencias de amplicones producidos por una plataforma NGS sigue siendo un obstáculo importante, que limita el uso y la adopción de software de análisis más rápido y conveniente.En total, se cultivaron 32 muestras fecales emparejadas de rebaños de ovejas suecas y las larvas se recolectaron posteriormente y se sometieron a secuenciación de amplicón del espaciador transcrito interno 2 (ITS2) utilizando la plataforma PacBio.Las muestras se analizaron con tres canalizaciones bioinformáticas diferentes, es decir, las canalizaciones DADA2, Mothur y SCATA, para determinar la composición y riqueza de especies.Para las principales especies analizadas en este estudio (Haemonchus contortus, Teladorsagia circumcinta y Trichostrongylus colubriformis), ni las abundancias relativas ni la diversidad de especies difirieron significativamente entre los tres procesos, lo que demuestra efectivamente que los tres procesos de análisis, aunque diferentes en sus enfoques, producen resultados casi idénticos. .Además, las muestras analizadas aquí tenían frecuencias especialmente altas de H. contortus (90–95 % en las tres tuberías) tanto antes como después del tratamiento de la muestra, seguido de T. circumcinta (3,5–4 %).Esto muestra que H. contortus es el parásito de principal importancia en las granjas ovinas suecas contemporáneas que luchan contra la resistencia antihelmíntica.Finalmente, aunque en promedio se logró una reducción significativa en el conteo de huevos después del tratamiento, no ocurrieron cambios significativos en las frecuencias relativas de las principales especies, lo que indica estructuras comunitarias muy rígidas en granjas de ovejas donde se ha informado resistencia a los antihelmínticos.Los hallazgos presentados aquí contribuyen aún más al desarrollo y la aplicación de la tecnología NGS para estudiar las composiciones de nemabioma en ovejas, además de ampliar nuestra comprensión sobre los cambios más recientes en la abundancia de especies de parásitos de las granjas de ovejas suecas que luchan contra la resistencia a los antihelmínticos.Las infecciones con parásitos helmintos son un hecho común en las granjas de todo el mundo.En general, las enfermedades asociadas con las especies de nematodos gastrointestinales pueden ir desde diarrea leve o letargo hasta anemia e incluso la muerte del animal infectado.Dado que los compuestos terapéuticos ofrecen la eliminación más confiable de parásitos de sus huéspedes, los costos del tratamiento junto con la pérdida de productividad en el ganado (por ejemplo, un aumento de peso más lento) resultan en pérdidas económicas significativas en el sector de producción animal [1].Además, el desarrollo de resistencia en las comunidades de nematodos parásitos tiene el potencial no solo de limitar los medicamentos disponibles para tratar los rebaños infectados [2,3,4,5] sino que también podría llevar a la selección de especies que son más patógenas y más propensas a desarrollar resistencia [6].Como consecuencia, el equilibrio en las comunidades complejas que ocurren de forma natural podría cambiar en el sentido de que las especies más patógenas y/o las especies más propensas al desarrollo de resistencia tienen más probabilidades de propagarse entre las granjas.En las ovejas suecas, aunque se conocen desde hace algún tiempo, se ha confirmado recientemente que las principales especies de nematodos gastrointestinales son Haemonchus contortus, Teladorsagia circumcinta y Trichostrongylus vitrinus [6], todas las cuales pertenecen al mismo orden: Strongylida.La presencia dominante de estas especies parece ser algo similar en otros países con clima templado, como Canadá [7] y el Reino Unido [8], a pesar de que existen diferencias en otros factores, como ubicaciones geográficas, técnicas de manejo y tratamiento de pastos. regímenes.Sin embargo, se sabe comparativamente poco sobre las interacciones de estas diferentes especies, cómo tales interacciones afectan al huésped, así como la influencia y la importancia de las especies que se encuentran con menos frecuencia.La metodología actual de "estándar de oro" para estimar la fracción sobreviviente de parásitos nematodos después del tratamiento y las composiciones de la comunidad en las parvadas generalmente se basa en contar los huevos de nematodos restantes presentes en las heces de los animales infectados y comparar estos recuentos con los obtenidos antes del tratamiento aplicado. , con posterior cultivo de las larvas infectivas de tercer estadio (L3) para la identificación de especies.Los problemas fundamentales con la realización de recuentos de huevos fecales (FEC) surgen del hecho de que las estimaciones obtenidas son solo aproximadas debido a la falta general de sensibilidad, especificidad y repetibilidad de tales ensayos, mientras que el cultivo de L3 implica un período de incubación de al menos 7 –14 días también la necesidad de expertos competentes en distinguir microscópicamente finas diferencias morfológicas entre las larvas.Por otro lado, mientras que los enfoques multiplex [9], tándem [10] y PCR digital de gotitas [11] pueden emplearse con éxito para evaluar la presencia y la abundancia relativa de especies de nematodos gastrointestinales (GIN) en muestras de parvadas, el rendimiento de tales ensayos es generalmente un factor limitante ya que la detección y estimación de la abundancia de parásitos solo puede ocurrir para un número relativamente pequeño de especies para las cuales el ensayo está optimizado a priori y cada muestra debe analizarse individualmente.El enfoque más moderno para analizar las composiciones de las comunidades de nematodos es mediante el uso del análisis de secuenciación de próxima generación (NGS) de bibliotecas multiplexadas que contienen fragmentos de secuencia de ADN del espaciador interno transcrito 2 (ITS2) del nematodo amplificado.Estos enfoques ya se han aplicado con éxito para estudiar la composición de la comunidad de nematodos en bovinos de carne [12], ovejas [6, 8], bisontes [13] y caballos [14].Aunque es relativamente nueva en el campo de la parasitología veterinaria, la aplicación de esta estrategia para analizar las comunidades de nematodos no solo producirá estimaciones más precisas y sensibles de la estructura de la comunidad de parásitos y del impacto de factores externos (como el tratamiento) en los cambios en la composiciones comunitarias, sino que también permite evaluaciones agrícolas a gran escala menos laboriosas y altamente robustas [7, 8, 15].La necesidad de una nueva herramienta de detección de la abundancia de parásitos se enfatiza aún más por los datos sobre la resistencia a los antihelmínticos en los nematodos de las ovejas, que sugieren problemas predominantes relacionados con las fallas generalizadas del tratamiento incluso en países bien desarrollados [4, 16].Sin embargo, el lado bioinformático del procesamiento de los datos de secuenciación de amplicones obtenidos de las plataformas NGS sigue siendo un obstáculo intimidante, sobre todo porque hay múltiples herramientas y enfoques de análisis diferentes disponibles, cada uno de dificultad variable y un impacto desconocido en las estimaciones finales de la abundancia de parásitos.En este estudio, nos enfocamos en describir y comparar pragmáticamente tres procesos diferentes (basados ​​en DADA2, Mothur y SCATA) y sus impactos en la estimación de la composición y riqueza de especies de nematodos en las muestras emparejadas de rebaños de ovejas suecas recuperadas más recientemente donde los tratamientos con sustancias antihelmínticas fueron emprendidas.Se recibieron muestras de granjas del centro-sur de Suecia como parte de un programa rutinario de control de la salud del rebaño que se lleva a cabo en granjas ovinas comerciales que experimentan problemas recurrentes con infecciones GIN.En total, se recolectaron 64 muestras pareadas (antes y después del tratamiento; de 21 granjas diferentes) entre 2017 y 2020, de las cuales 22 muestras se tomaron antes y después del tratamiento con albendazol (ABZ) (es decir, 11 antes, 11 después), 34 se tomaron antes y después del tratamiento con ivermectina (IVM) y ocho se tomaron antes y después del tratamiento con monepantel (MOP) (sin embargo, MOP solo se probó en 1 granja en diferentes ocasiones).Las muestras se recogieron antes y 10-14 días después del tratamiento con los fármacos antihelmínticos antes mencionados.Se tomaron muestras de entre 10 y 15 animales por parvada en cada ocasión en presencia de un veterinario autorizado.Las muestras fecales recolectadas se colocaron en bolsas selladas marcadas y se enviaron por correo nacional al laboratorio de diagnóstico donde se realizaron las estimaciones de FEC.Los conteos de huevos fecales para muestras recolectadas de ovejas se determinaron utilizando un método McMaster modificado como se describió anteriormente [17].Luego, las muestras fecales se usaron para incubar y recolectar L3 infectivas como se describió anteriormente [6].El ADN se extrajo con el kit de tejido de ADN Nucleospin (Macherey–Nagel, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) de acuerdo con las pautas del fabricante.Se utilizaron cebadores universales para la amplificación del ADN ribosómico (ADNr) del nematodo ITS2 (NC1–NC2), etiquetados con un código de barras de 8 pb en el extremo 5ʹ de NC1 y NC2, para generar bibliotecas de fragmentos de ITS2 para cada muestra;estas bibliotecas de fragmentos de ITS2 luego se agruparon.La amplificación, la limpieza y el control de la concentración, así como la pureza de las muestras, se llevaron a cabo como se describió anteriormente [6].Después de agrupar las bibliotecas individuales en concentraciones iguales, la secuenciación se llevó a cabo en un sistema PacBio SMRT cell V3 RSII en SciLifeLab, Uppsala, Suecia.Los datos de secuenciación sin procesar (archivos comprimidos.fastq) para grupos de larvas se procesaron con tres canalizaciones distintas que involucran DADA2 v.1.2 [18], SCATA (http://scata.mykopat.slu.se/) y Mothur v.1.46.1 [19] software de análisis.DADA2 es un paquete para R, diseñado para inferir variantes de secuencia de amplicón (ASV) a partir de datos de secuencia de amplicón.El enfoque DADA2 para el análisis de los datos de lectura de amplicón ITS2 generados con la plataforma Illumina está disponible (https://www.nemabiome.ca/dada2_workflow.html) y se utilizó aquí como referencia.Antes de esto, los datos de la secuencia se desmultiplexaron utilizando lima v.2.4 (lima-hifi-prefix SYMMETRICS; https://github.com/PacificBiosciences/barcoding).Luego, las lecturas demultiplexadas se sometieron a la eliminación del cebador usando Cutadapt v.3.4 [20] en Rstudio (v.4.1.0, https://www.rstudio.com/) (system2 (cutadapt, args = c (R1.flags, R2 .flags, '-n', 2, '-o', sample.cut [i], sample.[i]). número de error esperado (maxEE = 2) y rango de tamaño (200-450 pb). El conjunto de datos obtenido se usó como entrada para determinar las tasas de error usando la función de error ajustada específicamente para las lecturas generadas con la plataforma de secuenciación PacBio (learnErrors, errorEstimationFunction = PacBioErrfun). El mismo conjunto de datos se usó para realizar la eliminación de lecturas idénticas (derepFastq), mientras que la composición del grupo secuenciado se infirió luego usando el conjunto de datos de secuencia desreplicado como entrada (dada). Dado que los datos de secuenciación de PacBio son unidireccionales, leer no fue necesario fusionar los pares, finalmente se eliminaron las quimeras (removeBimeraDenovo; method ='consensus') y la asignación taxonómica de los ASV se llevó a cabo utilizando AssignTaxonomy junto con la base de datos de nematodos ITS2 apropiada en ese momento (versión 1.2) como referencia (https://www.nemabiome.ca/its2-database.html;en un formato FASTA normal apto para el análisis con DADA2) [21].Los datos taxonómicos faltantes se completaron manualmente con BLAST de los ASV no resueltos y seleccionando la especie candidata más probable (basada en el valor E).Mothur es un software gratuito de código abierto, adaptado para múltiples tipos de análisis de comunidades microbianas y basado en una interfaz de línea de comandos personalizada.La canalización de Mothur, como se describe en https://www.nemabiome.ca/mothur_workflow.html, se empleó para analizar las lecturas previamente demultiplexadas (con lima v.2.4) y recortadas (con Cutadapt v.3.4).Para ese propósito, las lecturas demultiplexadas para cada combinación de etiquetas de código de barras se concatenaron y convirtieron en un archivo.fasta (sed -n '1 ~ 4 s/^@/ > /p; 2 ~ 4p' in.fastq > out.fasta), mientras tanto, el archivo .groups se obtuvo extrayendo los encabezados de dicho archivo .fasta (sed -n '1 ~ 2p' file > file.out) y generando una columna adicional que contiene nombres de grupos (es decir, muestra) (sed -i "s /$/\t$group_name/). El paso de generación de contig se omitió y las lecturas se filtraron para retener secuencias entre 200 y 450 pb y que no contuvieran nucleótidos ambiguos (maxambig = 0). Las lecturas restantes se alinearon con las más recientes ( en ese momento) disponible (v1.2) base de datos de nematodos ITS2 (https://www.nemabiome.ca/its2-database.html; en el formato de alineación específicamente para Mothur) [21], y solo las secuencias que eran al menos Se mantuvo un 90 % de similitud con las entradas de la base de datos. La puntuación mínima de búsqueda durante los alineamientos se fijó en 10. Las secuencias retenidas se asignaron a grupos utilizando el k-nearEnfoque del vecino más cercano (k = 3).SCATA es una interfaz gratuita en línea basada en la web desarrollada inicialmente para el análisis de comunidades fúngicas, basada en datos de amplicones de secuencia ITS etiquetados.En SCATA, las secuencias de amplicón sin procesar (en formato .fastq) y un archivo que contiene la etiqueta (en formato .txt) se cargan manualmente en el sitio web sin ningún procesamiento previo.La demultiplexación, la limpieza y el agrupamiento de secuencias con SCATA se han utilizado previamente para estudiar secuencias ITS2 codificadas en metabarras pertenecientes a GIN [6] y estos pasos se siguieron aquí en gran medida con algunas excepciones, que creíamos que mejorarían el agrupamiento de secuencias más raras. especies.Brevemente, las lecturas de amplicón se eliminaron si sus cualidades medias de nucleótidos eran < 20 y si alguna de las cualidades de nucleótidos individuales era < 10. La longitud de lectura se restringió entre 200 y 450 pb.Las lecturas demultiplexadas y sin cebadores se asignaron a unidades taxonómicas operativas (OTU) utilizando el algoritmo de agrupamiento USEARCH [22] y al menos un 85 % de superposición en la longitud de la secuencia;se necesitaba una alineación por pares para la agrupación de secuencias en la misma OTU.El umbral para la distancia de agrupación (es decir, la disimilitud) se fijó en 0,001, los homopolímeros de más de 3 pb se colapsaron y se eliminaron los genotipos raros que aparecían menos de 10 veces en el conjunto de datos combinado.El resto de los parámetros se mantuvieron en sus valores por defecto.Blast+ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK279690/) junto con la base de datos de nematodos ITS2 disponible públicamente (v.1.2) (https://www.nemabiome.ca/its2-database.html ; en un formato FASTA regular) [21] para asignar las especies de nematodos más probables a cada OTU.Las tablas de datos obtenidos, que contienen ASV u OTU, así como las identificaciones taxonómicas de cada uno, los nombres de las muestras y la cantidad de lecturas prefiltradas (es decir, la cantidad de lecturas que fueron de 200 a 450 pb y sin nucleótidos ambiguos por muestra por ASV/OTU ) fueron sometidos a un filtrado adicional.Debido a la naturaleza ambigua de las lecturas singleton, optamos por eliminarlas, ya que potencialmente pueden inflar la diversidad [23, 24].Se establecieron dos cortes duros arbitrarios posteriores, como se sugirió anteriormente [25], para eliminar otras lecturas raras, que ascendieron a <0,5% del número total de lecturas para cada muestra y muestras juntas, si su número mínimo total de lecturas era < 100. Este paso fue un intento de medir con precisión la diversidad de especies y las frecuencias relativas.Dado que las medidas de diversidad de especies también dependen del número de secuencias obtenidas de las muestras, se podría haber realizado razonablemente un submuestreo aleatorio de todas las muestras hasta el tamaño de lectura de la más pequeña [26].Por otro lado, el submuestreo aleatorio de lecturas al tamaño de biblioteca más pequeño no tiene en cuenta los datos inflados a cero y posiblemente puede conducir a la exclusión de puntos de datos válidos y, por lo tanto, no se realizó aquí [24].El conjunto de datos final que contenía ASV/OTU, nombres de especies, nombres de muestra y el número de lecturas filtradas fusionó las lecturas de cada muestra si los ASV/OTU pertenecían a la misma especie.Para cada enfoque, se calcularon las frecuencias relativas de cada unidad taxonómica (es decir, especie) dividiendo las lecturas específicas de la especie por el número total de lecturas para cada muestra.La riqueza de especies para cada muestra en la categoría respectiva (ya sea antes o después del tratamiento) se estimó sumando la presencia de cada especie.La diversidad alfa, en forma de índices de Simpson inversos (1/D), se calculó para todas las muestras procesadas con cada tubería (tanto antes como después del tratamiento) usando el paquete vegano (https://CRAN.R-project.org /package=vegan;v.2.6.2) para R. Para determinar los índices de diversidad, los datos de abundancia relativa de las especies se ajustaron dividiendo cada valor de abundancia relativa por el más pequeño en ese conjunto de datos y redondeando al número entero más cercano.Se realizaron manipulaciones de datos adicionales (así como ilustraciones) con (el paquete ggplot2 v3.3.5 https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/index.html para) Rstudio.Se usó un análisis de varianza de una vía (ANOVA; usando el paquete stats v.3.6.2 y la función lm para R) para comparar las frecuencias relativas de las principales especies de nematodos, la riqueza y la diversidad alfa (índices de Simpson inversos) presentes en cualquiera de los muestras de tratamiento o postratamiento, así como entre los dos grupos, entre las diferentes tuberías.Se identificaron un total de 114 ASV (para 17 especies diferentes) mediante la canalización DADA2, se identificaron 218 grupos de secuencias (para 15 especies diferentes) mediante la canalización SCATA y el análisis con Mothur arrojó 13 especies diferentes.Siguiendo los pasos de filtrado del conjunto de datos, de las 64 muestras iniciales, 62 y 61 pasaron los criterios establecidos para las canalizaciones DADA2 y Mothur, respectivamente, mientras que 59 muestras pasaron los criterios establecidos para la canalización SCATA.En total, se obtuvieron 170 355 lecturas filtradas de alta calidad (un promedio de 2747,6 por muestra [rango 189–7140]) para las muestras analizadas con la canalización DADA2.En comparación, el conjunto de datos obtenido con Mothur dio como resultado 176 933 lecturas filtradas de alta calidad (un promedio de 2900,5 por muestra [rango 199–7417], y el análisis con SCATA produjo 68 037 lecturas filtradas de alta calidad (un promedio de 1153,1 por muestra). muestra [rango 110–2790]) (Archivo adicional 1: Tabla S1).De las 62/61 muestras para DADA2 y Mothur, se mantuvieron 56 (= 28 muestras pareadas);para SCATA, se mantuvieron 54 (= 27 muestras pareadas) de las 59 muestras iniciales.Debido a la falta de muestras (ya sea antes del tratamiento, después del tratamiento o ambos) para una o dos de las tuberías, la lista final de muestras compartidas, que consta de 50 muestras (25 pares intactos; 9 muestras pareadas para ABZ, 12 para IVM y 4 para MOP ), se utilizó para comparar la composición de especies, la riqueza y la diversidad entre las diferentes tuberías bioinformáticas.Para todos los oleoductos, H. contortus se encontró en 49 de 50 muestras retenidas, mientras que la segunda especie más abundante, Teladorsagia circumcinta (así como todas las demás), se encontró que estaba más distribuida localmente, es decir, en 17 (con Mothur y DADA2) y 15 (con SCATA) de las 50 muestras (Fig. 1).La composición de especies en muestras individuales analizadas (25 antes y 25 después del tratamiento) con tres tuberías diferentes.a–c Composiciones de muestras en términos de fracción (%) de cada especie individual en muestras de pretratamiento con las tuberías DADA2 (a), Mothur (b) y SCATA (c).d–f Composiciones de muestras en términos de fracción (%) de cada especie en muestras postratamiento con tuberías DADA2 (d), Mothur (e) y SCATA (f).Cada barra representa la composición de una muestra individual, analizada con una tubería particular, y cada color representa una especie diferente, como se indica en la leyenda.Las muestras en las categorías de tratamiento anterior o posterior se subdividieron en grupos según el fármaco que se utilizó para tratar las parvadas: ivermectina (IVM), albendazol (ABZ) o monepantel (MOP)La principal especie antes del tratamiento que se identificó con las tres tuberías fue H. contortus (abundancia relativa media 93–95 %), seguida de T. circumcinta (abundancia relativa media 3,5–3,7 %).Otras especies menos abundantes (≤ 1%) consistieron en Chabertia ovina (0,99%), Cylicocyclus nassatus (0,95%), Cylicostephanus goldi (0,23%), Cylicostephanus longibursatus (0,55%), Trichostrongylus axei (0,14%) y Trichostrongylus colubriformis ( 0,09 %) con DADA2, C. ovina (0,95 %), Cooperia curticei (0,02 %), T. axei (0,14 %) y T. colubriformis (0,12 %) con Mothur y C. ovina (0,89 %), C. nassatus (0,83 %), C. longibursatus (0,33 %), T. axei (0,11 %) y T. colubriformis (0,14 %) con la tubería de análisis SCATA (Fig. 2a–c; Archivo adicional 2: Tabla S2).No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre las medias de H. contortus o T. circumcinta en la categoría de pretratamiento al comparar las diferentes tuberías (ANOVA de una vía, df = 74, F = 0,04, P = 0,96 y df = 74 , F = 8e−04, P = 0,99, respectivamente).La estimación de la riqueza de especies tampoco reveló diferencias significativas entre los valores de riqueza promedio obtenidos con todas las tuberías (ANOVA de una vía, df = 74, F = 0.1, P = 0.83) (Fig. 2b).De acuerdo con datos anteriores, los índices de diversidad alfa para las muestras procesadas con las diferentes tuberías no mostraron una variación significativa (ANOVA unidireccional, df = 74, F = 0.4, P = 0.62; Archivo adicional 3: Figura. S1a).Las FEC medias en las muestras de pretratamiento fueron 3536 ± 4601 (valor medio 1725) huevos por gramo (hpg) (Fig. 2c).Comparaciones de las frecuencias relativas medias de las especies y la riqueza de especies entre los tres procesos antes y después del tratamiento, complementadas con datos de conteo de huevos.Las fracciones medias de cada especie principal (> 1 %) se compararon entre las tuberías para las muestras antes (a) y después del tratamiento (d).Los colores representan diferentes especies, o una colección de especies raras, como se indica en la leyenda.La riqueza de especies también se comparó entre las tuberías para las muestras antes (b) y después del tratamiento (e).También se muestran los recuentos de huevos para las muestras antes del tratamiento (c) y después del tratamiento (f).Los diagramas de caja dentro de los diagramas de violín para el conteo de huevos representan los valores medianosLas principales especies en las muestras posteriores al tratamiento en todas las tuberías fueron H. contortus (rango de abundancia relativa media: 90–91 %), T. circumcinta (rango de abundancia relativa media: 3,7–4,0 %) y T. colubriformis (rango de abundancia relativa media: rango: 2.0–2.1%).Con el oleoducto de Mothur, se encontró que C. curticei estaba presente con una abundancia relativa del 1,2 %, mientras que con los otros dos oleoductos, esta especie se encontró con una abundancia relativa < 1 % (0,51 % para SCATA y 0,94 % para DADA2) y, por lo tanto, se incluyó en la categoría Otras especies.Las especies más raras presentes en las muestras con ≤ 1 % de abundancia relativa también se incluyeron en la categoría Otras, entre las que se encontraban las siguientes especies: C. ovina (0,39 %), Cooperia fuelleborni (0,18 %), Cyathostomum catinatum (0,21 %), C. nassatus (0,02 %), C. longibursatus (0,12 %), Oesophagostomum venulosum (0,12 %), Ostertagia leptospicularis (0,08 %), T. axei (0,23 %) y Trichostrongylus vitrinus (0,64 %) con DADA2;C. ovina (0,38 %), O. venulosum (0,11 %), O. leptospicularis (0,07 %), T. axei (0,27 %), Trichostrongylus sin clasificar (0,09 %) y T. vitrinus (0,67 %) con Mothur;y C. ovina (0,43 %), C. fuelleborni (0,50 %), C. nassatus (0,02 %), C. longibursatus (0,29 %), O. venulosum (0,06 %), Ostertagia gruehneri (0,04 %), T. axei (0.23%) y T. vitrinus (0.66%) con SCATA (Fig. 2d-f; Archivo adicional 1: Tabla S1).No se observaron diferencias significativas al comparar las medias de cada especie principal con las tres tuberías diferentes después del tratamiento (ANOVA de una vía, df = 74, F = 0,005, P = 0,99 para H. contortus; df = 74, F = 0,01 , P = 0,98 para T. circumcinta, df = 74, F = 5e-04, P = 0,99 para T. colubriformis).No hubo diferencias significativas para los valores medios de riqueza de especies (ANOVA unidireccional, df = 74, F = 0,01 P = 0,98) o diversidad alfa (ANOVA unidireccional, df = 74, F = 0,002, P = 0,99) post -tratamiento, obtenidos con las diferentes tuberías, se encontraron (Fig. 2e; Archivo adicional 3: Figura S1b).Las FEC medias en las muestras posteriores al tratamiento fueron 1055 ± 1341 (valor medio: 205) hpg (Fig. 2f).A pesar de los cambios estadísticamente significativos en los recuentos de hpg observados después del tratamiento (ANOVA unidireccional, gl = 49, F = 6,7, P = 0,01), al comparar las frecuencias relativas medias de las tres especies principales, es decir, H. contortus, T. circumcinta y T. colubriformis, antes y después del tratamiento subsiguiente no arrojaron diferencias significativas para todas las tuberías, lo que no sorprende dada la alta abundancia relativa de ADN de H. contortus probablemente resistente en las muestras (ANOVA unidireccional, df = 49, F = 0,21 , P = 0,63, df = 49, F = 0,55, P = 0,45 y df = 49, F = 0,26, P = 0,60 para H. contortus con DADA2, Mothur y SCATA respectivamente, df = 49, F = 0,01, P = 0,92, df = 49, F = 0,008, P = 0,92 y df = 49, F = 0,002, P = 0,96 para T. circumcinta con DADA2, Mothur y SCATA, respectivamente y df = 49, F = 1, P = 0,31 , df = 49, F = 0,99, P = 0,32 y df = 49, F = 1, P = 0,32 para T. colubriformis con DADA2, Mothur y SCATA, respectivamente).No obstante, a nivel individual, muestras como IVM5 (cambio del 100 % de pretratamiento de H. contortus al 49-51 % de postratamiento de T. colubriformis), IVM6 (cambio del 79 % de pretratamiento de T. circumcinta al 87 % de postratamiento de H. contortus) y ABZ1 (cambio de 99 a 100 % de pretratamiento de H. contortus a 50 a 55 % de postratamiento de H. contortus) en la Fig. 1 mostraron cambios sustanciales en la composición de especies después del tratamiento.En general, no hubo cambios estadísticamente significativos en las medias de la riqueza de especies (ANOVA de una vía, df = 49, F = 2,1, P = 0,14 [DADA2]; df = 49, F = 2,2, P = 0,14 [Mothur] y df = 49, F = 3,7, P = 0,06 [SCATA]) o valores de diversidad alfa (ANOVA unidireccional, df = 49, F = 2,2, P = 0,13 [DADA2]; df = 49, F = 3,6, P = 0,06 [Mothur]; y df = 49, F = 2,8, P = 0,1 [SCATA]) se observaron tratamientos previos y posteriores en las tres tuberías.Aunque existen varias herramientas para la detección de especies GIN, así como para la estimación de las composiciones de la comunidad de parásitos, se ha demostrado que la secuenciación de bibliotecas multiplexadas con una plataforma NGS posee ventajas únicas en forma de mayor sensibilidad, especificidad, mayor rendimiento y sesgo limitado. 7, 8, 15].En el presente estudio, aplicamos este enfoque para estudiar muestras fecales pareadas de ovejas suecas antes y después del tratamiento con IVM, ABZ o MOP.Más importante aún, motivado por la brecha actual en nuestro conocimiento con respecto a los métodos para analizar los datos producidos por NGS y los resultados específicos de elegir una tubería bioinformática sobre la otra, comparamos tres enfoques bioinformáticos diferentes para estimar la abundancia de especies GIN en 25 muestras pareadas. de rebaños de ovejas suecos.Las muestras de parvadas estudiadas aquí se recuperaron de varias granjas que, según los propietarios, han luchado contra el parasitismo persistente, probablemente debido a la resistencia a los antihelmínticos.Por lo tanto, dado el origen de estas muestras, no sorprende que la abundancia relativa media de H. contortus, una especie conocida por ser capaz de desarrollar rápidamente resistencia a los fármacos [27, 28] y por ser omnipresente en Suecia [6], fuera tan alto (> 90% en las categorías de pre y post tratamiento).Este hallazgo parece confirmar que las granjas de ovejas suecas que experimentan infecciones parasitarias recurrentes en los rebaños a pesar del tratamiento tienden a verse afectadas de manera desproporcionada por H. contortus, mientras que otras especies que se encuentran en menor abundancia, como T. circumcinta e incluso Trichostrongylus sp., parecen estar más esporádicamente afectadas. distribuidos en comparativamente menos granjas.Además, entre las especies más raras (< 1 % de abundancia relativa media) identificamos varios parásitos estróngilos de caballos conocidos de los géneros Cylicocyclus, Cylicostephanus y Cyathostomum, así como uno que hasta ahora solo se ha encontrado en impalas y búfalos (Cooperia fuelleborni).No está claro por qué se encontraron estas especies en las muestras fecales recolectadas de ovejas;sin embargo, las especies de parásitos equinos también se han encontrado en muestras fecales de ovejas en niveles bajos en un estudio anterior [6].Dada la relativa rareza de estos parásitos en las muestras recuperadas, podría tratarse de un simple caso de contaminación cruzada de muestras durante la(s) fase(s) inicial(es) de recuperación, almacenamiento y/o manipulación de la muestra.Al mismo tiempo, no se puede descartar que la contaminación cruzada pudiera haberse originado por el hecho de que tanto ovejas como caballos a veces co-pastorean en los mismos pastos.Si bien estas especies que infectan a los caballos eran comparativamente raras, no fueron detectadas por el oleoducto de Mothur simplemente porque la base de datos de referencia actual (en el formato de alineación diseñado para usar con Mothur y descargado de https://www.nemabiome. ca/its2-database.html) no contiene ninguna de las secuencias para esas especies (es decir, nematodos inespecíficos de ovejas) a diferencia de la base de datos en un formato FASTA normal utilizado tanto para SCATA como para DADA2 (a pesar de que se obtuvieron de la misma fuente).Si bien no es raro que diferentes herramientas de análisis requieran archivos de entrada de diferentes formatos, esperamos que los curadores del sitio web actualicen en el futuro la base de datos de alineación de referencia para secuencias ITS2 de parásitos veterinarios, utilizada específicamente para Mothur.Los resultados de las muestras analizadas con las tres tuberías arrojaron frecuencias relativas casi idénticas para las especies principales, a saber, H. contortus, T. circumcinta y T. colubriformis, en sus respectivas categorías de tratamiento (Fig. 2a, d).Además, se demostró que tanto la riqueza de especies como los índices de diversidad también parecían verse afectados de manera insignificante por la tubería elegida (Fig. 2b, e; Archivo adicional 3: Figura S1), lo que demuestra efectivamente que las tres tuberías, a pesar de sus diferencias, resultaron en composiciones, riqueza y diversidad de especies comparables.A pesar de la disminución significativa en los recuentos de huevos obtenidos después del tratamiento (Fig. 2c, f), las frecuencias relativas medias de las especies principales, así como las medidas de riqueza y diversidad, se vieron afectadas de manera insignificante, lo que apunta a una estructura comunitaria rígida en la que la especie dominante es H. contortus, observación consistente con los datos obtenidos para las muestras recolectadas en el estudio previo [6].Una diferencia notable entre el estudio anterior y el trabajo aquí es que en lugar de identificar a T. vitrinus como una de las especies principales, encontramos que T. colubriformis es la especie dominante del género Trichostrongylus.Esto ilustra la importancia de realizar múltiples evaluaciones para establecer la abundancia precisa de diferentes especies de parásitos en un área geográfica grande.La mayoría de los estudios publicados recientemente que emplean NGS para estudiar los nemabiomas en varios animales huéspedes se han basado en la evaluación precisa de lecturas cortas producidas por la plataforma de secuenciación Illumina [7, 13, 15, 29].De hecho, hasta donde sabemos, existen pocos estudios sobre nematodos parásitos en los que la plataforma de secuenciación utilizada haya sido PacBio [6].Esto quizás no sea sorprendente dado que la plataforma Illumina se introdujo antes, ya que se considera parte de la segunda generación de secuenciación de ADN [30].Además, los estudios iniciales que comparan las dos plataformas han demostrado que, en la mayoría de los casos, tanto los costos de secuenciación con esta plataforma como las tasas de error fueron menores [31].Sin embargo, con el advenimiento de la tecnología de lectura HiFi, PacBio ha sido capaz de lograr una precisión > 99,9 %, al mismo tiempo que tiene en cuenta el sesgo de lectura corta inherente a la plataforma Illumina [32].Prev Vet Med.Parásito.Vectores de parásitos.Vectores de parásitos.Int J Parasitol Drogas Resistencia a las drogas.Parasitol veterinario.Parasitol veterinario.Parasitol veterinario.Parasitol veterinario.Int J Parasitol.Vectores de parásitos.Int J Parasitol.Más uno.Parasitol veterinario.Ciencia veterinaria frontal.Callahan BJ, McMurdie PJ, Rosen MJ, Han AW, Johnson AJA, Holmes SP.DADA2: inferencia de muestra de alta resolución a partir de datos de amplicón de Illumina.Métodos Nat.2016;13:581–3.Aplicación Environ Microbiol.BMC Genet.Bioinformática.Fitol nuevo.Ciencia de la planta frontal.Fitol nuevo.Microbiol Ambiental.Parasitol veterinario.Adv Parasitol.Vectores de parásitos.genómica.BMC Genómica.Fitol nuevo.Nat Rev Microbiol.BMC Bioinformática.bioRxiv.Nat Comun.Biol común.Más uno.Más uno.Más uno.Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.Los autores no tienen intereses contrapuestos que declarar.Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material.Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor.Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.La renuncia de Creative Commons Public Domain Dedication (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) se aplica a los datos disponibles en este artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito a los datos.Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt© 2022 BioMed Central Ltd a menos que se indique lo contrario.