Utilizamos cookies para mejorar su experiencia.Al continuar navegando en este sitio, acepta nuestro uso de cookies.Más información.Al combinar las técnicas de microscopía de fuerza atómica (AFM) y espectroscopía infrarroja (IR), conocidas como AFM-IR, las muestras se pueden caracterizar químicamente a nanoescala, proporcionando detalles que no serían posibles con las dos técnicas solas.La espectroscopia AFM-IR, también conocida como espectroscopia IR a nanoescala, tiene una lista cada vez mayor de áreas de aplicación, que incluyen microelectrónica, ciencia farmacéutica, caracterización de polímeros y ciencias de la vida.Este artículo presenta los principios de AFM-IR, explora sus avances y proporciona ejemplos de aplicaciones de AFM-IR en ciencias de la vida.Más específicamente, analiza la caracterización a nanoescala de muestras biológicas, incluidos tejidos, proteínas, monocapas y estructuras dentro de células individuales.La espectroscopia infrarroja (IR) es una técnica analítica popular para caracterizar materiales y realizar análisis químicos en laboratorios de I+D académicos, industriales y gubernamentales.Aunque la espectroscopia IR convencional a granel tiene muchas aplicaciones útiles, tiene un límite de difracción de 3 a 10 μm.La microscopía de fuerza atómica (AFM) es una técnica de imagen omnipresente a nanoescala que proporciona a los usuarios un mapa topográfico de alta resolución espacial (aprox. 1 nm) de la superficie de una muestra.Si bien AFM es valioso para visualizar la superficie de un material;no es capaz de caracterizar químicamente el material de interés.Sin embargo, cuando se combina con una fuente de IR, la técnica AFM-IR resultante reduce el límite de difracción de la espectroscopia IR convencional en varios órdenes de magnitud.Esta combinación proporciona las capacidades de imágenes de alta resolución de AFM al tiempo que permite el análisis químico del material mediante el espectrofotómetro IR.1,2El sistema fototérmico AFM-IR funciona iluminando primero la muestra con un láser IR pulsado sintonizable.La radiación IR será absorbida si el número de onda de la fuente láser resuena con una frecuencia de vibración molecular en la muestra.Después de intercambiar energía con la matriz de la muestra, las moléculas vuelven a su estado vibratorio fundamental.Luego, la muestra se expande térmicamente sobre un área correspondiente al punto del láser IR enfocado.Como resultado de la expansión térmica local del material en la proximidad de la punta de la sonda AFM, el voladizo puede comenzar a oscilar;la oscilación posterior es proporcional a la radiación absorbida por la muestra.A medida que el voladizo y la punta comienzan a moverse a través de una muestra, los datos topográficos y las imágenes químicas se recopilan a nanoescala.Durante la configuración inicial de AFM-IR fototérmico, la fuente de láser sintonizable del oscilador paramétrico óptico (OPO) tiene una longitud de pulso de ~ 10 ns y una tasa de repetición de 1 kHz.Esto da como resultado la rápida expansión de la muestra, lo que provoca un impulso en el voladizo, lo que hace que la oscilación del voladizo suene hacia abajo en sus frecuencias de resonancia naturales después de cada pulso láser.Los avances más recientes de AFM-IR fototérmico reemplazan la fuente de láser sintonizable OPO con un láser de cascada cuántica de tasa de repetición variable (QCL).Esto da como resultado una mejora de la señal fototérmica AFM-IR en dos órdenes de magnitud (Figura 1).Figura 1. Diagrama óptico de un experimento AFM-IR que muestra la diferencia entre las respuestas de la señal usando una fuente láser OPO de tasa de repetición de 1 kHz y una fuente QCL con su tasa de repetición sintonizada a un modo de frecuencia de resonancia de contacto del voladizo AFM.Adaptado de Marcott et al5.Crédito de la imagen: Superficies Bruker NanoEsta mejora se logra ajustando la tasa de repetición de QCL para que coincida con el modo de frecuencia de resonancia de contacto del voladizo AFM.3,4 En la resonancia de contacto, la amplitud de oscilación del voladizo aumenta considerablemente en relación con las frecuencias fuera de resonancia.La señal AFM-IR se puede mejorar aún más utilizando una punta AFM recubierta de oro.Esto da como resultado un efecto de "pararrayos", que localiza el campo eléctrico en el vértice de la punta.Al utilizar una sonda recubierta de oro, además de hacer coincidir la tasa de repetición del láser con la resonancia de contacto del voladizo AFM, se pueden obtener espectros IR para muestras de hasta ~10 nm de espesor.Si se deposita una muestra de película delgada sobre un sustrato de oro, el campo eléctrico local se puede mejorar aún más, lo que permite mediciones de hasta 1 nm.Por lo tanto, la técnica fototérmica AFM-IR, si se opera en modo de resonancia mejorada, puede detectar coberturas monocapa de material sobre superficies metálicas a resoluciones espaciales laterales de hasta 25x25 nm.AFM-IR se ha utilizado para responder a una multitud de preguntas de investigación en las ciencias de la vida y caracterizar una variedad de muestras biológicas.A continuación se proporcionan ejemplos de la caracterización a nanoescala de muestras biológicas, incluidos tejidos, proteínas, monocapas y estructuras dentro de células individuales.Estos resultados no se habrían obtenido sin la utilización de técnicas AFM-IR.El estudio de Giliberti et al.(2019) utilizaron AFM-IR para investigar los cambios conformacionales inducidos por la luz de un mutante de bacteriorrodopsina (BR) dentro de parches de la membrana púrpura de Halobacterium halobium, un microorganismo captador de luz.6BR es una proteína fotosensible que actúa como una bomba de protones.Al mover protones a través de la membrana, la energía luminosa se convierte posteriormente en energía química.Los cambios conformacionales que ocurren en esta proteína sensible a la luz y su cofactor son la base de sus funciones fisiológicas.Las técnicas de espectroscopia IR y AFM no son suficientes por sí solas para estudiar este sistema, ya que requiere una caracterización química detallada a nanoescala.AFM se puede utilizar para detectar corrientes eléctricas que viajan a través de monocapas de proteínas, pero no cambios conformacionales en las proteínas.La espectroscopia IR tradicional se puede utilizar para rastrear los cambios conformacionales en las proteínas, pero la muestra generalmente debe ser una película gruesa o una suspensión líquida que contenga un alto volumen de proteína purificada.Mediante el uso de técnicas AFM-IR con la adición de una superficie de oro y AFM recubierto de oro, el estudio encontró una mejora significativa en la relación señal-ruido en comparación con la nanoespectroscopia IR estándar.Además, se registraron espectros de diferencia de IR en el rango de 1450-1800 cm-1 de áreas de muestra de monocapa tan delgadas como 10 nm y con un diámetro de menos de 500 nm.Esto supera con creces el límite de difracción de la espectroscopia IR tradicional.Debido al nivel de detalle a nanoescala proporcionado por el AFM-IR, hubo una fuerte evidencia espectroscópica de ramificación en el fotociclo de las moléculas BR en las superficies de oro.Aquí es donde cantidades iguales de proteínas están presentes después del fotociclo de la bomba de protones o existen en un estado intermedio y no contribuyen al fotociclo.Este estudio actúa como modelo para futuros estudios de espectroscopia AFM-IR que investigan cambios conformacionales de proteínas incrustadas en membranas.El estudio de Ramer et al.(2018) realiza un análisis conformacional de polipéptidos a nanoescala en entornos acuosos.7Por lo general, las proteínas funcionan plegándose en estructuras tridimensionales y uniéndose a otras moléculas, formando complejos funcionales.Se reconoce que la espectroscopia IR es una herramienta importante para caracterizar químicamente la estructura secundaria de proteínas tanto en estado sólido como acuoso.Sin embargo, el límite de difracción de la espectroscopia IR tradicional tiene una resolución de 3-10 μm lateralmente, por lo que anteriormente, las estructuras de proteínas a nanoescala no podían analizarse químicamente.La capacidad de caracterización química a nanoescala de AFM-IR ha facilitado la identificación de conformaciones polipeptídicas en fibrillas de proteínas individuales y otras estructuras proteicas de tamaño submicrónico.Esto ha llevado a una mayor comprensión de procesos importantes, como la agregación de proteínas y los mecanismos de plegamiento incorrecto.Como parte de esta investigación, se empleó AFM-IR para sondear agregados supramoleculares de difenilalanina, el módulo de reconocimiento central del péptido B-amiloide de la enfermedad de Alzheimer, así como su derivado, Boc-difenilalanina.Mediante el uso de AFM-IR, los autores adquirieron espectros IR de alta resolución y mapas en sustratos de agua y aire, lo que resultó en relaciones señal/ruido comparables.Posteriormente, esto permitió la identificación de estados estructurales y químicos de redes morfológicamente similares a nivel de agregado único, como la fibrilla (Figura 2).Figura 2. Medición AFM-IR de fibrillas de difenilalanina (FF) en aire y H2O.morfología y mapa de absorción IR (1615 cm−1) para fibrillas FF en (A) aire y (B) H2O.(C) Comparación de los espectros AFM-IR promedio que cubren las regiones espectrales de la banda amida I (verde), amida II (azul) y anillo C-C (naranja).(D) Comparación de las segundas derivadas de los espectros en la banda de amida I y la absorción del anillo C-C.Adaptado de G. Ramer, FS Ruggeri, A. Levin, TPJ Knowles y A. Centrone, ACS Nano 12, 6612−6619 (2018)7.Crédito de la imagen: Superficies Bruker NanoPor ejemplo, los datos químicos se recopilaron fácilmente a partir de fibrillas individuales de menos de 200 nm lateralmente.Obtener una resolución tan alta no habría sido posible solo con la espectroscopia IR clásica.Antes de este estudio, AFM-IR solo se había realizado en materiales secos debido a la preocupación de que el secado de un material que contiene proteínas pueda provocar un cambio conformacional en la estructura de la columna vertebral de la proteína.El éxito de usar AFM-IR para una muestra acuosa en este estudio sirve como prueba de concepto.Pérez-Guaita et al.(2018) utilizaron análisis de imágenes multivariantes para producir mapas AFM-IR multivariantes para facilitar la recopilación de información subcelular de alta resolución en glóbulos rojos infectados con el parásito de la malaria, Plasmodium falciparum, en una variedad de etapas a lo largo del desarrollo.8Esta metodología apoyó de manera única la generación de mapas de composición de las estructuras subcelulares de los parásitos, incluidas las inclusiones de lípidos, la vacuola alimentaria y el núcleo, en función de la intensidad de las bandas del marcador IR de lípidos, hemoglobina, hemozoína y ADN, respectivamente (Figura 3).Figura 3. Imágenes AFM-IR de un trofozoíto de P. falciparum dentro de un glóbulo rojo.(A) topografía AFM.(B) Mapa de desviación de AFM que muestra la ubicación de los puntos donde se midieron los espectros, dentro (azul) y fuera (rojo) de la protuberancia.(C, D) Espectros medidos a partir de la señal del pico de intensidad IR (V) que muestran diferentes bandas para los puntos rojos y azules en las regiones 1450-950 y 1800-1450 cm-1, respectivamente.(E, F) Mapas de picos IR obtenidos a 1207 y 1660 cm−1, respectivamente.(G, H) Gráficos de puntuación y carga del PCA aplicados a la región de 3100-2800 cm-1.D. Pérez-Guaita, K. Kochan, M. Batty, C. Doerig, J. García-Bustos, S. Espinoza, D. McNaughton, P. Heraud y BR Wood.Anal.química90, 3140−3148 (2018)8.Crédito de la imagen: Superficies Bruker NanoAl combinar el modelado de datos hiperespectrales con la alta resolución de AFM-IR, las estructuras subcelulares se identificaron directamente, eliminando la necesidad de tinción bioquímica o seccionamiento celular.Con la capacidad de fenotipar el desarrollo del parásito dentro de los glóbulos rojos, esta tecnología puede facilitar el estudio de los fenotipos de parásitos resistentes a los medicamentos y los posibles modos de acción de los medicamentos antipalúdicos.AFM-IR se ha aplicado a la detección in vivo de cambios moleculares durante procesos celulares en células individuales de bacterias.Kochan et al.empleó la espectroscopia AFM-IR para observar cambios moleculares a nanoescala en la pared celular de la bacteria Staphylococcus aureus durante la división celular.9Los cambios dinámicos en la pared celular se producen mientras Staphylococcus aureus se somete a división celular.Dichos cambios incluyen alteraciones en los componentes moleculares y el engrosamiento del tabique (Figura 4).El diámetro del tabique recién formado era de aproximadamente 45 nm.Figura 4. (A) Altura de AFM y (B) Imagen de deflexión de AFM de la celda en división recolectada antes de registrar los espectros de AFM-IR en los puntos marcados, a partir de los cuales se registraron los espectros (sin tabique en negro y formando tabique en rojo).Tamaño del área fotografiada por AFM: 1,17 1,15 mm.(C, D) Comparación de espectros AFM-IR registrados desde el tabique (rojo) y sin tabique (negro) de la célula de S. aureus durante la división en el rango espectral (C) 1800–900 cm-1 y (D) 1400 –900 cm−1.Los espectros se normalizaron a la banda de amida I.(E) Las segundas derivadas de los espectros presentados en (C), con marcadas bandas diferenciadoras prominentes.(F) La segunda derivada de un espectro diferencial obtenido mediante la resta del espectro sin tabique (C, negro) del espectro del tabique (C, rojo), con bandas prominentes marcadas.Adaptado de Kochan et al9.Crédito de la imagen: Superficies Bruker NanoEl espectro AFM-IR obtenido de esta estructura exhibió una mayor intensidad y ampliación de algunas bandas (centradas en 1228 y 1088 cm-1 y atribuidas a los grupos fosfodiéster y carbohidratos de los componentes de la pared celular) en comparación con un espectro de un área fuera del tabique. .La segunda derivada de un espectro diferencial, adquirida mediante la sustracción de un espectro sin tabique del espectro del tabique, mostró bandas centradas en 1240 y 1092 cm-1 (modos de fosfodiéster y carbohidrato).La caracterización química de la estructura del tabique en una célula viva a alta resolución solo es posible con AFM-IR.Este estudio muestra la capacidad de AFM-IR como herramienta para obtener información molecular sobre los procesos celulares in vivo y en detalle a nanoescala.En un estudio posterior de Kochan et al., el análisis quimiométrico se combinó con la espectroscopia AFM-IR para identificar alteraciones en la composición química de Staphylococcus aureus.Este estudio se centró en el desarrollo de resistencia a los antibióticos a la daptomicina y la vancomicina a nivel de una sola célula.10Kochan et al.se centró en el uso de aislados clínicos emparejados para facilitar la asignación de cambios específicos al desarrollo de resistencia.Para la vancomicina, se observó un aumento en los carbohidratos, lo que indica un engrosamiento o cambios en el empaquetamiento de la pared celular.Por el contrario, en daptomicina se observó un aumento en el contenido de fosfolípidos asociado con el desarrollo de no susceptibilidad.Este estudio muestra la aplicación potencial de las técnicas AFM-IR para la detección de resistencia a los antimicrobianos a nivel de una sola bacteria.AFM-IR se ha empleado para definir las diferencias bioquímicas entre los tejidos de las glándulas salivales sanas y tumorales.Un estudio de Paluszkiewicz et al.(2020) fue la primera investigación AFM-IR de glándula salival sana versus tejido tumoral.11Usando AFM-IR, el estudio detectó áreas similares a fibrillas dentro del tejido tumoral, con las formas amiloides caracterizadas más pequeñas de 70 nm;de lo contrario, esto no se habría detectado utilizando solo la espectroscopia IR tradicional.Se recogieron los espectros IR de la estructura similar a fibrillas del tejido tumoral y el tejido marginal (no tumoral), las áreas fuera de las fibrillas del tumor, como se ve en la Figura 5.Figura 5. Los espectros AFM-IR promediados de las secciones de tejido de las glándulas salivales en el rango espectral 1800–900 cm−1;la estructura similar a fibrillas del tejido tumoral (A), las áreas fuera de las fibrillas del tejido tumoral (B) y el tejido marginal (C).Crédito de la imagen: Superficies Bruker NanoDebido a las capacidades de IR a nanoescala, los autores observaron un mayor contenido de hoja β en áreas similares a fibrillas dentro de un tumor de glándula salival, dado por espectros IR, en comparación con las regiones dentro del tumor fuera de las fibrillas.Este grado de diferenciación de la estructura de la proteína secundaria no habría sido posible usando microespectroscopia Raman o IR convencional.La capacidad de detectar diferencias bioquímicas entre el tejido sano y el tejido tumoral puede ayudar a la progresión de la terapia a través del desarrollo de fármacos con acción específica informada por la investigación.La espectroscopia IR a nanoescala se puede utilizar para caracterizar topográfica y químicamente muestras biológicas a nanoescala, incluidos tejidos, proteínas, monocapas y estructuras dentro de células individuales.El AFM-IR fototérmico utiliza un láser IR para irradiar una muestra y provocar una expansión térmica.La punta AFM detecta la expansión térmica, lo que hace que oscile en proporción a la expansión térmica.Con la adición de un láser de cascada cuántica (QCL), la señal se puede mejorar en dos órdenes de magnitud en comparación con la espectroscopia y la formación de imágenes AFM-IR convencionales.Esto se debe a que su tasa de repetición puede adaptarse a frecuencias de resonancia mecánica específicas en el voladizo AFM.Se puede lograr una mejora adicional de dos órdenes de magnitud en la sensibilidad recubriendo la punta del AFM con oro y moldeando las películas de muestra sobre sustratos de oro.Es la fusión del efecto de "pararrayos" producido al recubrir la punta AFM con oro y sustrato, junto con la mejora de resonancia utilizando la fuente QCL, lo que facilita la detección de monocapas de material a resoluciones espaciales de 25 x 25 nm.Incluso en presencia de agua, el AFM-IR fototérmico con mejora de resonancia es una herramienta valiosa comprobada para obtener la caracterización química de películas de proteínas y tipos de muestras adicionales en las ciencias de la vida.Los pocos ejemplos discutidos aquí describen cómo AFM-IR ya se usa para responder a una variedad de preguntas biológicas diferentes.Mediante el uso de AFM-IR, los investigadores han realizado nuevos hallazgos en estructuras secundarias en proteínas relacionadas con el Alzheimer, fenotipos del desarrollo del patógeno de la malaria en glóbulos rojos, ramificación del fotociclo en moléculas de bacteriorrodopsina, cambios bioquímicos en tejidos cancerosos y detección in vivo de moléculas cambios durante los procesos celulares.AFM-IR es una tecnología excepcionalmente práctica y de vanguardia que brinda a los investigadores las herramientas para responder preguntas que requieren análisis topográficos y químicos a nivel de nanoescala de muestras biológicas y más allá.Producido a partir de materiales escritos originalmente por Curtis Marcott de Light Light Solutions, así como por Savana Lipps y Miriam Unger de Bruker.Esta información se obtuvo, revisó y adaptó a partir de materiales proporcionados por Bruker Nano Surfaces.Para obtener más información sobre esta fuente, visite Bruker Nano Surfaces.Utilice uno de los siguientes formatos para citar este artículo en su ensayo, documento o informe:Superficies Bruker Nano.(2022, 23 de marzo).Cómo detectar muestras biológicas en detalle a nanoescala.AZoNano.Recuperado el 28 de mayo de 2022 de https://www.azonano.com/article.aspx?ArticleID=5864.Superficies Bruker Nano."Cómo detectar muestras biológicas en detalle a nanoescala".AZoNano.28 de mayo de 2022.